Department of Genetics

CRISPR-Cas ตอนที่ 6

การใช้เทคนิค CRISPR-Cas เพื่อปรับแต่งยีน มีปัญหาและข้อจำกัดเกิดขึ้นหลายประการ เช่น การเกิดเหตุการณ์ off-target ซึ่งหมายถึง มีการปรับแต่งยีนตำแหน่งอื่นๆ ในจีโนมที่ไม่ใช่แค่ยีนเป้าหมาย ทั้งนี้เนื่องจาก guide RNA (gRNA) ที่ออกแบบสามารถจับกับเบสบริเวณอื่นนอกเหนือจากบริเวณของยีนเป้าหมาย และข้อจำกัดของโปรตีน Cas9 คือ เอนไซม์ต้องการ Protospacer Adjacent Motif (PAM) sequence ที่มีลำดับเบส NGG (N คือ เบส A/T/C/G) เพื่อจับบนสายดีเอ็นเอ ซึ่งบางครั้งอาจพบได้ไม่บ่อยในจีโนมของสิ่งมีชีวิตบางชนิด

ดังนั้น นักวิทยาศาสตร์จึงทำการปรับแต่งโปรตีน Cas9 และเพิ่มลักษณะต่างๆ เพื่อให้มีประสิทธิภาพมากขึ้นและนำมาใช้เพื่อวัตถุประสงค์ต่างๆ ได้หลากหลายขึ้น เช่น

1. การผลิตรีคอมบิแนนท์ Cas9

ในปัจจุบันมีหลากหลายรูปแบบ เพื่อนำมาใช้ในการทำงานที่แตกต่างกัน เช่น

1.1 การสร้าง Cas9 nickase (nCas9) ที่มีการเปลี่ยนลำดับกรดอะมิโนที่ active site ของเอนไซม์นี้ได้ 2 ตำแหน่งคือ กรดอะมิโนตำแหน่งที่ 10 ซึ่งเปลี่ยนจาก aspartate เป็น alanine (D10A) และกรดอะมิโนตำแหน่งที่ 840 ซึ่งเปลี่ยนจาก histidine เป็น alanine (H840A) ส่งผลให้ nCas9 ตัดสายดีเอ็นเอได้เพียง 1 สาย

1.2 การสร้าง Cas9 ให้จดจำลำดับเบสของ PAM ได้หลากหลายมากขึ้น (PAM-modified Cas9) หรือแม้กระทั่งไม่ต้องการลำดับเบส PAM

1.3 การปรับแต่ง Cas9 เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการตัดสายดีเอ็นเอที่แม่นยำมากขึ้น (High-fidelity Cas9)

1.4 การสร้าง dead Cas9 (dCas9) เพื่อกำจัดการทำงานของ endonuclease ทำให้ไม่เกิดการตัดสายดีเอ็นเอ โดย dCas9 จะถูกใช้เป็นตัวกลางเพื่อเชื่อมกับโปรตีนตัวอื่น ส่วนใหญ่มีวัตถุประสงค์ที่ไม่เกี่ยวข้องกับการปรับแต่งยีน เช่น เชื่อมต่อกับ transcriptional activator/repressor เพื่อศึกษาการทำงานของยีน หรือเชื่อมต่อกับ reporter protein เช่น green fluorescent protein (GFP) เพื่อดูตำแหน่งของลำดับเบสที่สนใจในจีโนม

2. การเพิ่มเอนไซม์หรือโปรตีนชนิดอื่นเชื่อมต่อกับ Cas9 เช่น

2.1 การใส่เอนไซม์ cytidine deaminase เพื่อทำหน้าที่เป็น cytosine base editors (CBEs) ซึ่งเอนไซม์นี้จะดึงหมู่เอมีน (amine) ออกจากเบสไซโตซีน (C) ส่งผลให้เปลี่ยนเป็นเบสยูราซิล (U) เกิดการเปลี่ยนแปลงเบสในเส้นดีเอ็นเอเป็นเบสไทมีน (T) หลังจากเซลล์เกิดการจำลองดีเอ็นเอ

2.2 การใส่เอนไซม์ adenine deaminase เพื่อทำหน้าที่เป็น adenine base editors (ABEs) ทำหน้าที่ดึงหมู่เอมีนออกจากเบสอะดีนีน (A) ส่งผลให้เกิดการกลายเป็นเบสกวานีน (G)

ทั้ง CBEs และ ABEs ใช้ nCas9 โดยเทคนิคนี้เพิ่มประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงเบสที่แม่นยำมากขึ้น และทำให้เกิดเหตุการณ์ off-target ลดลง โดย CBEs และ ABEs เป็นกลุ่ม base editors ที่นำมาใช้ในรุ่นแรกๆ มีคุณสมบัติทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงเบสแบบ transition (การเปลี่ยนแปลงเบสในกลุ่มเดียวกัน; เช่น ในกลุ่มพิวรีน เปลี่ยนจาก A เป็น G; G เป็น A ในกลุ่มไพริมิดีน เปลี่ยนจาก C เป็น U หรือ T) ในปัจจุบันนักวิทยาศาสตร์ได้ประยุกต์ใช้เอนไซม์ที่สามารถเปลี่ยนแปลงเบสแบบ transversion (การเปลี่ยนเบสต่างกลุ่ม) เพื่อทำให้เกิดความหลากหลายของการเปลี่ยนแปลงเบสมากขึ้น

2.3 การทำ prime editing เป็นการเชื่อมเอนไซม์ reverse transcriptase เข้ากับ nCas9 ซึ่งเรียกว่า prime editors (PEs) โดยต้องออกแบบ gRNA ให้มีคุณสมบัติที่เพิ่มมากขึ้น ด้วยการเพิ่มลำดับเบสเพื่อให้เป็นสายต้นแบบให้กับเอนไซม์ reverse transcriptase และต้องมีส่วน primer binding sequence (PBS) เพื่อสำหรับจับกับสายดีเอ็นเอตรงเส้นที่ต้องการเปลี่ยนแปลงเบส โดย gRNA ที่มีลักษณะเพิ่มขึ้นมาจะเรียกว่า prime editing guide RNA (pegRNA) ซึ่งเทคนิคนี้ เอนไซม์ reverse transcriptase จะใช้เบสบางส่วนของ pegRNA เป็นสายต้นแบบเพื่อสังเคราะห์สายดีเอ็นเอที่มีลำดับเบสเปลี่ยนแปลงไปจากเดิม ทำให้การเปลี่ยนแปลงเบสมีความแม่นยำมากขึ้น

3. การใช้ Cas ชนิดอื่น

มีการนำ Cas ชนิดอื่นมาใช้ในงานต่างๆ ที่หลากหลายมากขึ้น เช่น

3.1 Cas12 มีคุณสมบัติตัดสายดีเอ็นเอได้เป็นแบบปลายเหนียว (sticky ends) ซึ่งแตกต่างจาก Cas9 ที่ตัดดีเอ็นเอเป็นแบบปลายทู่ (blunt ends) ใช้สำหรับการปรับแต่งยีนและการตรวจสอบลำดับเบสที่จำเพาะ เช่น การตรวจหายีนของเชื้อโรค การตรวจหาการเกิดการกลายของเซลล์มะเร็ง

3.2 Cas13 มีคุณสมบัติที่แตกต่างออกไป คือสามารถตัดอาร์เอ็นเอสายเดี่ยวได้ (single strand RNA; ssRNA) การประยุกต์ใช้ Cas13 จึงเกี่ยวข้องกับการลดการแสดงออกของยีนในระดับอาร์เอ็นเอ (gene silencing) หรือการปรับแต่งอาร์เอ็นเอ (RNA editing) และการนำไปตรวจยีนของไวรัสต่างๆ

3.3 Cas14 มีขนาดเล็กกว่า Cas9 ครึ่งนึง สามารถตัดดีเอ็นเอได้ 1 สาย ไม่ต้องการลำดับเบส PAM ในการทำงาน ดังนั้นจึงนำมาประยุกต์ใช้งานได้หลากหลาย

เอกสารอ้างอิง
Azeez SS, Hamad RS, Hamad BK, Shekha MS, Bergsten P. Advances in CRISPR-Cas technology and its applications: revolutionising precision medicine. Front Genome Ed. 2024 Dec 12;6:1509924.
doi: 10.3389/fgeed.2024.1509924.
Lee, J., Kweon, J. & Kim, Y. Emerging trends in prime editing for precision genome editing. Exp Mol Med 57, 1381–1391 (2025). https://doi.org/10.1038/s12276-025-01463-8
https://blog.addgene.org/single-base-editing-with-crispr
https://www.synthego.com/guide/crispr-methods/prime-editing/

ขอเชิญผู้ที่สนใจเข้าร่วมฟังการสอบปากเปล่าขั้นสุดท้ายของนิสิตระดับปริญญาโท

คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ เปิดรับนิสิตใหม่ TCAS รอบ 3 ปีการศึกษา 2569 ✨

🗓️ เปิดรับสมัคร: วันที่ 6 - 12 พฤษภาคม 2569 นี้!
💻 สมัครออนไลน์: ผ่านระบบ TCAS ของ ทปอ. ที่เว็บไซต์: https://mytcas.com/
🔬 พบกับหลากหลายสาขาวิชา จำนวน 719 คน ดังนี้:
1. คณิตศาสตร์ รับจำนวน 22 คน
2. เคมี รับจำนวน 61 คน
3. ชีววิทยา รับจำนวน 23 คน
4. สถิติ รับจำนวน 20 คน
5. วิทยาศาสตร์ชีวภาพรังสี รับจำนวน 15 คน
6. ฟิสิกส์ รับจำนวน 40 คน
7. จุลชีววิทยา รับจำนวน 59 คน
8. พันธุศาสตร์ รับจำนวน 47 คน
9. พฤษศาสตร์ รับจำนวน 25 คน
10. สัตววิทยา รับจำนวน 28 คน
11. ชีวเคมี รับจำนวน 40 คน
12. วิทยาการคอมพิวเตอร์ รับจำนวน 23 คน
13. วิทยาศาสตร์นิวเคลียร์ รับจำนวน 35 คน
14. วิทยาศาสตร์พื้นพิภพ รับจำนวน 36 คน
15. เคมีอุตสาหกรรม รับจำนวน 28 คน
16. สถิติ ภาคพิเศษ รับจำนวน 65 คน
17. วิทยาการคอมพิวเตอร์ ภาคพิเศษ รับจำนวน 67 คน
18. วิทยาศาสตร์ชีวภาพและเทคโนโลยี หลักสูตรนานาชาติ รับจำนวน 35 คน
19. เคมีบูรณาการ หลักสูตรนานาชาติ รับจำนวน 30 คน
20. วิทยาการและเทคโนโลยีพอลิเมอร์ หลักสูตรนานาชาติ รับจำนวน 20 คน

💰 อัตราค่าธรรมเนียมการศึกษา (แบบเหมาจ่าย) สำหรับนิสิตใหม่ ปีการศึกษา 2569:
* ภาคปกติ: 21,000 บาท
* วิทยาการคอมพิวเตอร์ (ภาคพิเศษ): 56,600 บาท
* สถิติ (ภาคพิเศษ): 40,000 บาท
* วิทยาการและเทคโนโลยีพอลิเมอร์ (นานาชาติ): 60,500 บาท
* วิทยาศาสตร์ชีวภาพและเทคโนโลยี (นานาชาติ): 60,900 บาท
* เคมีบูรณาการ (นานาชาติ): 64,500 บาท

🔎 อยากรู้รายละเอียดเพิ่มเติม? คลิกเลย! 👉 https://admission.ku.ac.th/

ภาควิชาพันธุศาสตร์ ได้รับนักเรียนชั้นมัธยมศึกษาปีที่ 5 จำนวน 3 คน จากโรงเรียนปากเกร็ดวิทยา เข้าฝึกงานปฏิบัติการด้านพันธุศาสตร์ จากโครงการฝึกปฏิบัติการทางวิทยาศาสตร์สำหรับนักเรียนระดับชั้นมัธยมศึกษาตอนปลาย ตั้งแต่วันที่ 20 เมษายน - 6 พฤษภาคม พ.ศ. 2569 ภายใต้การดูแลของ ผศ.ดร.พีรภัฎ รุ่งสัทธรรม และ รศ.ดร.อัญชณี คูเบอร่า

“จากการปรับปรุงพันธุ์แบบดั้งเดิม สู่การใช้เทคโนโลยีปรับแต่งจีโนม”

เส้นทางของการพัฒนาพืชไม่ได้หยุดอยู่แค่การคัดเลือกและผสมพันธุ์อีกต่อไป
วันนี้ วิทยาศาสตร์ช่วยให้เรา “แก้ไขยีน” ได้อย่างแม่นยำและรวดเร็ว

เทคโนโลยีนี้จะเปลี่ยนอนาคตการเกษตรและความมั่นคงทางอาหารของโลกอย่างไร?

🌱 มาร่วมค้นหาคำตอบไปพร้อมกัน

🎥 รับชมคลิป:

Biology IPST จากการปรับปรุงพันธุ์แบบดังเดิม สู่การใช้เทคโนโลยีปรับแต่งจีโนม

ขอเชิญผู้สนใจเข้าฟังการบรรยายจากนักวิจัยรับเชิญ
โดย Yasuyo Yamaoka
จาก Catholic University of Korea

🧬 หัวข้อการบรรยาย:
Lipid Metabolism and Stress Responses in Microalgae and Duckweeds: From Fundamental Mechanisms to Biotechnological Applications

📅 วันที่: 6 พฤษภาคม 2026
⏰ เวลา: 11:00 – 12:00 น.
📍 สถานที่: อาคารวินิจ เจียมสกุล ห้อง 305

You are cordially invited to attend the PhD Thesis Defense.

มาทำความเข้าใจเรื่อง Genome Editing หรือเทคโนโลยีการปรับแต่งจีโนม กัน

ภาพบรรยากาศกิจกรรมปัจฉิมนิเทศ นิสิตพันธุศาสตร์ชั้นปีที่ 4 เมื่อวันที่ 31 มีนาคม 2569

ภาพบรรยากาศการนำเสนอโครงงานพันธุศาสตร์ ภาคปลาย ปีการศึกษา 2568
โดยนิสิตพันธุศาสตร์ชั้นปีที่ 4 เมื่อวันที่ 31 มีนาคม 2569